La Chrom HPLC D-7000

!!!Use the operator book!!! DO NOT FORGET!!!!

Everybody who is using the HPLC should enter his name, the uesed colum, the solvent mixture and the back pressure of the system in the user book.

Assembly

A HPLC consists of different parts. The La Chrom HPLC D-7000 in room 118 is made up of the folowing modules

La Chrom HPLC analytisch
Module	Product Number	Picture	Manual
Solvent bottles		solvent bottles
Pump	L7100	Datei:.png binäre Pumpe	binäre Pumpe
Autosampler/ Injector	L-7200	Datei:.png Autosampler	Autosampler;
DAD-Detector	L-7455	Datei:.png DAD-Detektor	DAD-Detektor
Column oven	L-7350	Datei:.jpg Säulenofen	Säulenofen
Solvent waste		Datei:.png LM-Abfall
Computer (Windows 2000)		Datei:.png Rechner

Vorbereitung

Säule

Vor der Inbetriebnahme der HPLC muss die gewünschte Säule eingebaut werden falls diese nicht bereits eingebaut ist. Es ist darauf zu achten, dass die verwendete Säule den gewünschten Bedingungen stand hält (pH, Druck, Lösungsmittel etc.). Bei Einbau ist darauf zu achten, dass die Anschlüsse alle dicht sind. Nach dem Einbau der Säule, kann diese wenn gewünscht im Säulenofen temperiert werden.

Lösungsmittel

* Vor jeder Messung ist es nötig den Füllstand der Lösungsmittelflaschen zu überprüfen und nach dem Auffüllen im Programm einzustellen. * Es ist darauf zu achten, dass nur Lösungsmittel entsprechender Qualität verwendet werden. In ihnen dürfen sich keine Partikel befinden. Diese würden die Kapillaren und Ventile verstopfen. Korrosive Lösungen (z.B. Alkalilösungen, Salzlösungen und Halogensäuren) dürfen nicht verwendet werden. * Die Lösungsmittel müssen mit der verwendeten Säule kompatibel sein, auch in Bezug auf pH-Wert. * Bei der Verwendung von Puffer-Lösungen müssen diese zuvor filtriert werden. * Um bakterielles Wachstum zu unterbinden ist der Zusatz von 0,1 % TFA zum Lösungsmittel sinnvoll, ansonsten muss das Wasser bzw. Puffer alle 2 Tage getauscht werden.

Abfall

Alle Abfallbehälter sollten vor Messbeginn geprüft werden und gegebenenfalls geleert oder ausgetauscht werden (zwei Stück).

Proben

Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Teil der HPLC-Analyse. Um Kontamination der Säule das Ausfallen der Probe auf der Säule zu vermeiden, ist es wichtig die Probe in einem entsprechenden Lösungsmittelverhältnis zu lösen und zu filtrieren. Die Probe sollte zu jeder Zeit gelöst sein und dürfen nicht im Laufmittelgemisch ausfallen. So ist es nicht sinnvoll bei RP-Phase die Probe in reinem Methanol oder ACN zu lösen, da die Gefahr groß ist, dass die Probe bei einem polareren Laufmittelgemisch auf der Säule ausfällt und nicht über die Säule transportiert wird. Das Ausfallen von Proben auf der Säule verursacht zum einen eine Steigerung des Rückdrucks bis hin zur Verstopfung der Säule, zum anderen die Bildung von Kanälen im Säulenmaterial, welches die Trennleistung verschlechtert.

In welchem Lösungsmittelgemisch soll ich nun meine Probe lösen?

Diese Frage kann nicht pauschal beantwortet werden. Es ist wichtig das sie dauerhaft in Lösung ist. Wie kann man dies praktisch machen? Zunächst wiegt man z.B. etwa 1 mg seiner Probe ab und versucht dieses in 500 µL reinem Methanol bzw. ACN zu lösen. Ist dies möglich (klare Lösung) kann in 100 µL Schritten Wasser zugegeben werden, und gleichzeitig beobachtet werden ob etwas ausfällt (Lösung sich eintrübt). Hat man insgesamt 500 µL zu gegeben und die Lösung ist noch klar kann man diese mit einem Spritzenfilter in ein Vial filtrieren. Man hat nun eine Probenlösung mit einem Lösungsmittelverhältnis von 50:50 (Methanol/ACN:Wasser) und kann jetzt ohne Gefahr, dass die Probe ausfällt, alle Laufmittelmischungsverhältnisse zwischen 100% Methanol/ACN und 50:50 Methanol/ACN:Wasser verwendet. Will man für die Trennung ein Laufmittelmischungsverhältnis verwenden, welches einen höheren Wasseranteil hat muss zuvor eine anderes Probenlösungsmittelverhältnis gewählt werden. Fällt während der Zugabe die Probe aus so verringert sich der Laufmittelmischungsverhältnis-Bereich entsprechend.