Agilent 1100/1200 semipräparativ

!!!IN DAS BENUTZERBUCH EINTRAGEN!!! NICHT VERGESSEN!!!!

In das Benutzerhandbuch sollte der Name des Anwenders, die verwendete Säule und das verwendete Lösungsmittelgemisch und der entsprechende Rückdruck eingetragen werden.

Aufbau

Eine HPLC setzt sich aus verschiedenen Baugruppen zusammen. Die semipräparative HPLC von Agilent aus Raum 309 besteht aus folgenden Baugruppen.

Agilent HPLC Semipräp
Baugruppe	Produktnummer/ Seriennummer	Foto	Herstelleranleitung
Lösungsmittel Kabinett		Lösungsmittel Kabinett
Degasser/ Entgaser	G1379A/ JP13208442	Degasser	Degasser
Pumpe	G1311A/ DE82203503	quaternäre Pumpe	quaternäre Pumpe
Autosampler/ Injektor	G1313A/ DE11116863	Autosampler	Autosampler; 900µL Injektorschleife
DAD-Detektor	G1315A/ DE82203687	DAD-Detektor	DAD-Detektor
Fraktionssammler	G1364C/ DE63055760	Fraktionssammler	Fraktionssammler
Steuerelement	G1323B/ CN23607228	Steuerelement	Steuerelement
Säulenofen	ST 85P jet/ 50521	Säulenofen	Säulenofen
Lösungsmittelabfall Hinterkolbenspülung		Lösungsmittelabfall-Hinterkolbenspülung
Lösungsmittelabfall (Purgeventil (Pumpe)/ Injektor/ Fraktionssammler)		Lösungsmittelabfall
Rechner (Windows 7)		Rechner

Vorbereitung

Säule

Vor der Inbetriebnahme der HPLC muss die gewünschte Säule eingebaut werden, falls diese nicht bereits eingebaut ist. Es ist darauf zu achten, dass die verwendete Säule den gewünschten Bedingungen standhält (pH, Druck, Lösungsmittel etc.). Beim Einbau ist darauf zu achten, dass die Anschlüsse alle dicht sind. Nach dem Einbau der Säule kann diese, wenn gewünscht, im Säulenofen temperiert werden.

Lösungsmittel

Vor jeder Messung ist es nötig den Füllstand der Lösungsmittelflaschen zu überprüfen und nach dem Auffüllen im Programm einzustellen (Hinterkolbenspülung nicht vergessen). Es ist darauf zu achten, dass nur Lösungsmittel entsprechender Qualität verwendet werden. In ihnen dürfen sich keine Partikel befinden, da diese die Kapillaren und Ventile verstopfen würden. Korrosive Lösungen (z.B. Alkalilösungen, Salzlösungen und Halogensäuren) dürfen nicht verwendet werden! Die Lösungsmittel müssen mit der verwendeten Säule kompatibel sein, auch in Bezug auf den pH-Wert. Bei Flussraten größer 2 ml/min empfiehlt es sich die verwendeten Lösungsmittel zuvor zu entgasen. Bei der Verwendung von Puffer-Lösungen müssen diese zuvor filtriert werden. Um bakterielles Wachstum zu unterbinden ist der Zusatz von 0,1 % TFA zum Lösungsmittel sinnvoll, ansonsten muss das Wasser bzw. das Wasser/Puffer-Gemisch alle 2 Tage getauscht werden.

Abfall

Alle Abfallbehälter sollten vor Messbeginn geprüft werden und bei Bedarf entsprechend geleert oder ausgetauscht werden (Hinterkolbenspülung nicht vergessen).

Proben

Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Teil der HPLC-Analyse. Um Kontamination der Säule oder das Ausfallen der Probe auf der Säule zu vermeiden, ist es wichtig die Probe in einem entsprechenden Lösungsmittelverhältnis zu lösen und zu filtrieren. Die Probe sollte zu jeder Zeit gelöst sein und darf nicht im Laufmittelgemisch ausfallen. So ist es nicht sinnvoll bei RP-Phase die Probe in reinem Methanol oder ACN zu lösen, da die Gefahr groß ist, dass die Probe bei einem polareren Laufmittelgemisch auf der Säule ausfällt und nicht über die Säule transportiert wird. Das Ausfallen von Proben auf der Säule verursacht zum einen eine Steigerung des Rückdrucks bis hin zur Verstopfung der Säule, zum anderen wird die Bildung von Kanälen im Säulenmaterial gefördert, welches die Trennleistung verschlechtert.

In welchem Lösungsmittelgemisch soll ich nun meine Probe lösen?

Da für die semipräparative Reinigung in der Regel zuvor an der analytischen HPLC eine Methode entwickelt wurde, kann auf Grundlage der dabei gesammelten Erfahrung ein sinnvolles Probenlösungsmittelgemisch ausgewählt werden.

Fraktionssammler

Falls der Fraktionssammler verwendet werden soll muss dieser zuvor mit kleinen Probengläschen bestückt werden.

Starten

Vor dem Starten der HPLC ist es wichtig die entsprechenden Vorbereitungen (siehe vorherigen Absatz) zu treffen.

Erklärung	Bild
Zum Starten der HPLC müssen zunächst die einzelnen Bauelemente angeschaltet werden. (0) Rechner (falls dieser noch nicht läuft) (1) Fraktionssammler (2) DAD-Detektor (3) Autosampler/ Injektor (4) quaternäre Pumpe (5) Degasser/ Entgaser	Startreihenfolge
Um die semipräparative HPLC zu starten muss zunächst die Verknüpfung "Präp LC online" mit einem Doppelklick (linke Maustaste) geöffnet werden.	Desktop
Nach dem Klicken verbinden sich die Bauelemente der HPLC mit dem Rechner.	Start Initializing
Nach dem sich der Fraktionssammler initialisiert hat (1) (~2 min, hierfür muss er geschlossen sein!!), muss eine Methode geladen werden (2).	Methode laden
Hierfür wird der Menüreiter "Load Method" (1) ausgewählt.	Methode laden
Im erscheinenden Menü wird eine der Purge-Methoden, abhängig von bei der Messung verwendeten Kanälen, gewählt. Will man z. B. später mit einer Mischung aus Methanol (Kanal C) und Wasser (Kanal A) die HPLC betreiben, würde man Methode _PURGE_AC_10MIN_2ML_MIN (1, 2) verwenden. _PURGE_AB_10MIN_2ML_MIN _PURGE_ABC_10MIN_2ML_MIN _PURGE_ABCD_10MIN_2ML_MIN _PURGE_AC_10MIN_2ML_MIN	Methode laden
Die Ausgewählte Methode wird im Programm angezeigt (1).	Methode laden
Um das HPLC-System zu reinigen muss das Purgeventil geöffnet werden (1) und die HPLC gestartet werden (2).	Purgeventil öffnen Starten der HPLC
Dabei wird die Pumpe und der DAD-Detektor initialisiert. Im Schaubild färbt sich sobald das System bereit ist der "Pumpenpfeil" und die "DAD-Detektorwelle" grün. Danach läuft über den Purgeventil-Auslauf Lösungsmittel in den Lösungsmittelabfall. Die Lösungsmittelzuleitungen sollten 5-10 min gespült werden. Im Schlauchsystem von Lösungsmittelkabinett bis Purgeventil-Auslauf sollten idealerweise keine Luftblasen sein. Der eingebaute Degasser hat nur eine begrenzte Kapazität, so dass es bei hohen Flussraten nicht zur vollständigen Entgasung kommt.	Initialisierung der quaternären Pumpe und des DAD-Detektors komplett eingeschaltetes System Purgeventil-Auslauf
Nach dem Reinigen wird die Pumpe in "Standby" geschaltet, dabei färbt sich der der "Pumpenpfeil" grau (1, 2, 3, 4). Danach muss das Purgeventil geschlossen (5) werden.	Öffnen des Pumpenmenüs Control Standby; OK Pumpe Standby (grau) Purgeventil schließen

Methode editieren/ erstellen

Um Substanzen auf der HPLC zu trennen braucht man eine Methode. Der einfachste Weg eine neue Methode zu erstellen besteht im Editieren einer vorhandenen Methode.

Erklärung	Bild
Zum editieren einer Methode muss der Menüreiter "Method" ausgewählt werden (1) und "Edit Entire Method..." angeklickt werden (2).	Methode editieren
Die Editierung aller Bereiche mit OK (1) bestätigen.	Ok
Im Methoden Informationsbereich sollte eine Übersicht der Methodenparameter eingetragen werden (1) und mit OK (2) bestätigt werden. Name Lösungsmittel-Mischungsverhältnis Flussrate Injektionsvolumen Säulenofentemperatur Detektorwellenlänge Info Fraktionssammler Methodendauer In unserem Beispiel: Methode_Doktorand_2 20% Wasser/Puffer; 0% Acetonitril; 80% Methanol; 0% Isopropanol 2,5 mL/min 30 µL RT 254 nm threshold-peakbased 30 min Diese Informationen bilden den Header des Reports einer Messung.	Methoden-Info
Im Pump-Einstellungsbereich können pumpenrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (6) bestätigt werden. (1) Lösungsmittel-Mischungsverhältnis (2) Flussrate (3) Methodendauer (4) Druck-Limits (5) Gradienteneinstellungen In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) 20% Wasser/Puffer; 0% Acetonitril; 80% Methanol; 0% Isopropanol (2) 2,5 mL/min (3) 30 min (4) 3-200bar (unteren Druck nur beim Purgen auf 0 bar setzen, ansonsten besteht die Gefahr, dass die Säule trocken läuft. Das obere Drucklimit ist durch die Druckbeständigkeit des Säulenmaterials und des DAD-Detektors begrenzt. (5) isokratisch	Pumpen-Einstellung
Im Injektions-Einstellungsbereich können injektionsrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (3) bestätigt werden. (1) Injektionsvolumen (2) Injektionsart In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) 30 µL (2) Standard	Injektor-Einstellung
Im DAD-Detektor-Einstellungsbereich können detektorrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. (1) Substanzwellenlängen (Wellenlänge bei dem die Substanz absorbiert), Referenzwellenlänge (liegt in der Regel höher als die zugehörige Signalwellenlänge, hier sollte das Lösungsmittel nicht absorbieren) (2) Detektionszeit (stimmt in der Regel mit Methodendauer überein) (3) verwendete Lampen (Lampen decken unterschiedliche Wellenbereiche ab UV bzw. Vis) (4) UV-Spektrum (hier wird eingestellt zu welchem Zeitpunkt ein gesamtes UV-Absorptionsspektrum online mitgemessen wird) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) Sub: 254nm; Ref: 360nm (2) 30min (3) UV & Vis (4) None	DAD-Einstellung
Im Fraktionssammler-Einstellungsbereich können Parameter, die den Fraktionssammler betreffen, eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. (1) Sammelart (zeitabhängig bzw. peakabhängig) (2) max. Peakbreite (ist dieser Wert zu gering eingestellt wechselt das Auffanggefäß ständig) (3) Detektorwahl mit Sammelparameter (4) Wann gesammelt wird? (ob nur eine oder mehrere Bedingungen erfüllt sein müssen) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) Peak-based (2) 6 min (3) DAD-Detektor; Threshold only, Threshold Unit 10.0 (4) at least one selected peak detector (da nur ein Detektor angeschlossen ist, ist egal was man hier anklickt)	DAD-Einstellung
Im Messsignal-Einstellungsbereich können die Messsignale der Methode zu sortiert werden und mit OK (2) bestätigt werden. (1) Signal (da nur ein Detektor angeschlossen ist, hat man die Wahl zwischen verschiedenen Wellenlängen). In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) DAD1 A, Sig=254nm	DAD-Einstellung
Im Report-Einstellungsbereich kann das Format des Reports angepasst werden. Da dies in den meisten Fällen für uns nicht relevant ist und später auch noch während der Auswertung entsprechend angepasst werden kann, kann hier die Editierung mit Cancel (1) abgebrochen werden.	Report-Einstellung
Anschließend wird der Abbruch mit OK (1) bestätigt.	Report-Einstellung
Zuletzt muss die Methode gespeichert werden (1, 2) und ein gewünschter Methodenname gewählt werden (3, 4). Ein Kommentar zur Änderung ist nicht nötig einfach mit OK (5) bestätigen. Die gespeicherte Methode wird automatisch geladen (6).	Methode speichern Methode speichern Methode speichern Methode speichern

Messen

Nachdem durch "Purgen" die Luft aus den Zuleitungen gespült wurde kann eine zuvor erstellte Methode geladen werden und die Säule mit dem gewünschten Lösungsmittelgemisch ~30 min eingespült werden. Säulen mögen keine zu starken Wechsel in der Polarität des Laufmittels, so dass Wechsel von Laufmittelgemischen mit stark unterschiedlichen Polaritäten schrittweise erfolgen sollten, um Risse im Säulenbett vorzubeugen. Nach dem Einspülen der Säule müssen die vorbereiteten Proben in den Probentisch des Autosamplers gestellt werden und Angaben zu Position etc. in die Sequenztabelle eingetragen werden.

Probentabelle erstellen

Erklärung	Bild
Zum Erstellen der Sequenztabelle muss zunächst das Probentischsymbol angeklickt werden (1) und der Menüreiter "Sequence Table" ausgewählt werden. (2).	Probentisch Sequence table
In der sich öffnenden Sequenztabelle kann die Position des Vials (1), der Name der Probe (2) die gewünschte Methode (3) und die Anzahl der Injektionen/Messungen (4) der Probe eingegeben werden. Will man mehr als eine Probe messen kann man durch klicken von "Insert" (5) eine neue Zeile oberhalb, durch klicken von "Append Line" (6) eine Zeile unterhalb einfügen und wie zuvor ausfüllen. Mit " Undo All" (7) stellt man den Ursprung der Tabelle wieder her. Nach der Eingabe aller zu vermessenden Proben wird die Eingabe mit OK (8) bestätigt.	Sequence table
Nachdem man zurück ins "Hauptmenü" gekommen ist muss erneut das Probentischsymbol angeklickt werden (1), aber diesmal der Menüreiter "Sequence Parameters..." ausgewählt werden (2).	Probentisch Sequence Parameters
In dem sich öffnenden Menüfenster kann der Speicherort der gemessenen Chromatogramme bestimmt werden (1). Außerdem wird hier auch der Dateiname inklusive Nummerierung festgelegt wenn eine ganze Sequenz gemessen wird (3). In diesem Menüfenster wird auch der Anwender eingetragen, der später auf dem Report erscheint (2). Wurden alle Änderungen eingetragen bestättigt man diese mit OK (4).	Sequence Parameters

Messung starten

Erklärung	Bild
Zurück im Hauptmenü kann durch Anklicken von Start (1) die Messung gestartet werden. Bei laufender Messung sind die Symbole für Injektor, Säule und DAD-Detektor blau.	Start Messung
Ist die Messung fertig speichert sich das Chromatogramm automatisch beim zuvor unter "Sequence Parameter" angegebenen Ort ab und es öffnet sich ein Report den man ausdrucken kann. Die Messdaten können später auch noch offline eingesehen und ausgewertet werden.	fertige Messung

Spülen

Hat man die letzte Messung beendet muss die Säule gespült werden und im vom Hersteller angegebenen Lösungsmittelgemisch gelagert werden. Üblicherweise werden die Säulen 20-30 min mit einem Lösungsmittelgemisch gespült, welches einen höheren organischen Anteil hat als jenes, welches zuvor für die Messung verwendet wurde. Hierfür lädt man am besten eine entsprechende Spülmethode. Nach dem Spülen wechselt man dann zum vom Hersteller angegebenen Lösungsmittelgemisch und konditioniert sie für weitere 10 min, bevor man die Pumpe im Programm ausschaltet.

Erklärung	Bild
Eine Möglichkeit für die Spül- und Konditionierungs-Prozedur besteht im Schreiben und Starten einer entsprechender Sequenz. Dazu ruft man den "Sequence Table" auf (1) und trägt hier eine Spül- (2) und Konditionierungs-Sequenz (3) ein. Anschließend bestätigt man diese mit OK (4).	"Sequence table" "Sequence table"
Im Folgenden ruft man das "Sequence Parameter" Menü auf (5). Dort kann eingestellt werden, dass die UV-Lampe und die Pumpe in Standby geht, sobald die Messung der Sequenz beendet ist (6). Diese Einstellung bestätigt man mit OK (7) und startet die Sequenz (8).	"Sequence Parameter" Messung

Schließen

Erklärung	Bild
Ist die Sequenz durchgelaufen, öffnet sich das Reportfenster und die Pumpe und die UV-Lampe schalten sich aus. Nun kann das Reportfenster geschlossen werden (1).	Lauf
Da die Pumpe und die UV-Lampe ausgeschalte sind (grau) (2,3), kann auch das Programm Präp LC online geschlossen werden (4).	Programm schließen
Die Nachfrage ob man das Programm wirklich schließen will kann einfach bestätigt werden (1), ebenso die Frage ob die Pumpe und die Lampe aus ist (2), sofern diese grau unterlegt sind.	Programm schließen Programm schließen Programm schließen
Nun können die einzelnen Bauteile der HPLC ausgeschaltet werden.	HPLC ausschalten

Auswerten

Die Auswertung kann entweder an Hand des ausgedruckten Reports oder an Hand eines im offline Programm (Präp LC offline) von Chemstation modifizierten Reports erfolgen. Von Interesse sind hierbei insbesondere die Retentionszeiten und Integrale der einzelnen Signale, auch das UV-Spektrum der einzelnen Signale gibt wichtige Hinweise.

Abschließende Hinweise

Vor Verwendung der HPLC ist es sinnvoll seine Zielsetzung klar zu definieren. Für eine gute Dokumentation bietet es sich an bei jeder Messung einen Laufzettel zu verwenden, in dem alle Parameter der Messung vermerkt sind, um eine Reproduzierbarkeit bei erneuten Messungen zu gewährleisten. Ein Vordruck kann hier oder im Desktopbereich des HPLC-Computers gefunden werden und bei Bedarf ausgedruckt werden.