Agilent 1100/1200 analytisch

Aufbau

Eine HPLC setzt sich aus verschiedenen Baugruppen zusammen. Die analytische HPLC von Agilnet aus Raum 318 besteht aus folgenden Baugruppen.

Agilent HPLC analytisch
Baugruppe	Produktnummer/ Seriennummer	Foto	Herstelleranleitung
Lösungsmittel Kabinett		Lösungsmittel Kabinett
Degasser/ Entgasser	G1379A/ JP13208442	Degasser	Degasser
Pumpe	G1312A/ DE14911360	binäre Pumpe	[[:Datei:|binäre Pumpe ]]
Autosampler/ Injektor	G1313A/ DE14919450	Autosampler	Autosampler;
DAD-Detektor	G1315D/ DE64256451	DAD-Detektor	DAD-Detektor
Säulenofen	ST 85P jet/ 50521	Säulenofen	Säulenofen
Lösungsmittelabfall		LM-Abfall
Rechner (Windows 7)		Rechner

Vorbereitung

Säule

Vor der Inbetriebnahme der HPLC muss die gewünschte Säule eingebaut werden falls diese nicht bereits eingebaut ist. Es ist darauf zu achten, dass die verwendete Säule den gewünschten Bedingungen stand hält (pH, Druck, Lösungsmittel etc.). Bei Einbau ist darauf zu achten, dass die Anschlüsse alle dicht sind.

Lösungsmittel

• Vor jeder Messung ist es nötig den Füllstand der Lösungsmittelflaschen zu überprüfen.
• Es ist darauf zu achten, dass nur Lösungsmittel entsprechender Qualität verwendet werden. In ihnen dürfen sich keine Partikel befinden. Diese würden die Kapillaren und Ventile verstopfen. Korrosive Lösungen (z.B. Alkalilösungen, Salzlösungen und Halogensäuren) dürfen nicht verwendet werden.
• Die Lösungsmittel müssen mit der verwendeten Säule kompatibel sein, auch in Bezug auf pH-Wert.
• Bei der Verwendung von Puffer-Lösungen müssen diese zuvor filtriert werden.
• Um bakterielles Wachstum zu unterbinden ist der Zusatz von 0,1 % TFA zum Lösungsmittel sinnvoll, ansonsten muss das Wasser bzw. Puffer alle 2 Tage getauscht werden.

Abfall

Alle Abfallbehälter sollten vor Messbeginn geprüft werden und gegebenenfalls geleert oder ausgetauscht werden ( zwei Stück).

Proben

Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Teil der HPLC-Analyse. Um Kontamination der Säule das Ausfallen der Probe auf der Säule zu vermeiden, ist es wichtig die Probe in einem entsprechenden Lösungsmittelverhältnis zu lösen und zu filtrieren. Die Probe sollte zu jeder Zeit gelöst sein und dürfen nicht im Laufmittelgemisch ausfallen. So ist es nicht sinnvoll bei RP-Phase die Probe in reinem Methanol oder ACN zu lösen, da die Gefahr groß ist, dass die Probe bei einem polareren Laufmittelgemisch auf der Säule ausfällt und nicht über die Säule transportiert wird. Das Ausfallen von Proben auf der Säule verursacht zum einen eine Steigerung des Rückdrucks bis hin zur Verstopfung der Säule, zum anderen die Bildung von Kanälen im Säulenmaterial, welches die Trennleistung verschlechtert.

In welchem Lösungsmittelgemisch soll ich nun meine Probe lösen?

Diese Frage kann nicht pauschal beantwortet werden. Es ist wichtig das sie dauerhaft in Lösung ist. Wie kann man dies praktisch machen? Zunächst wiegt man z.B. etwa 1 mg seiner Probe ab und versucht dieses in 500 µL reinem Methanol bzw. ACN zu lösen. Ist dies möglich (klare Lösung) kann in 100 µL Schritten Wasser zugegeben werden, und gleichzeitig beobachtet werden ob etwas ausfällt (Lösung sich eintrübt). Hat man insgesamt 500 µL zu gegeben und die Lösung ist noch klar kann man diese mit einem Spritzenfilter in ein Vial filtrieren. Man hat nun eine Probenlösung mit einem Lösungsmittelverhältnis von 50:50 (Methanol/ACN:Wasser) und kann jetzt ohne Gefahr, dass die Probe ausfällt, alle Laufmittelmischungsverhältnisse zwischen 100% Methanol/ACN und 50:50 Methanol/ACN:Wasser verwendet. Will man für die Trennung ein Laufmittelmischungsverhältnis verwenden, welches einen höheren Wasseranteil hat muss zuvor eine anderes Probenlösungsmittelverhältnis gewählt werden. Fällt während der Zugabe die Probe aus so verringert sich der Laufmittelmischungsverhältnis-Bereich entsprechend.

Starten

Vor dem Starten der HPLC ist es wichtig die entsprechenden Vorbereitungen (siehe vorherigen Absatz) zu treffen.

Erklärung	Bild
Zum Starten der HPLC müssen zunächst die einzelnen Bauelemente angeschaltet werden. DAD-Detektor Autosampler/ Injektor binäre Pumpe Degasser/ Entgasser Rechner (falls dieser noch nicht läuft)	Startreihenfolge
Um die analytische HPLC zu starten muss zunächst die Verknüpfung "Analytik LC online" mit einem Doppelklick (linke Maustaste) geöffnet werden.	Desktop
Nach dem Klicken verbinden sich die Bauelemente der HPLC mit dem Rechner.	Start Initializing
Anschließend muss eine Methode geladen werden. Hierfür wird der Menüreiter "Load Method" (1,2) ausgewählt.	Methode laden
Im erscheinenden Menü wird eine der Purge-Methoden, abhängig von bei der Messung verwendeten Kanälen, gewählt. Will man z. B. später mit einer Mischung aus Acetonitril (Kanal B) und Wasser (Kanal A) die HPLC betreiben würde man Methode "_PURGE_AB_10MiN_2ML_MIN" (1, 2) verwenden. _PURGE_AB_10MiN_2ML_MIN _PURGE_ABC_10MiN_2ML_MIN _PURGE_ABCD_10MiN_2ML_MIN _PURGE_AC_10MiN_2ML_MIN	Methode laden
Die Ausgewählte Methode wird im Programm angezeigt (1).	Methode laden
Um das HPLC-System zu reinigen muss das Purgeventil geöffnet werden (1) und die HPLC gestartet werden (2).	Purgeventil öffnen Starten der HPLC
Dabei wird die Pumpe und der DAD-Detektor ininitialisiert. Im Schaubild färbt sich sobald das System bereit ist der "Pumpenpfeil" und die "DAD-Detektorwelle" grün. Danach läuft über den Purgeventil-Auslauf Lösungsmittel in den Lösungsmittelabfall. Die Lösungsmittelzuleitungen sollten 5-10 min gespült werden. Im Schlauchsystem von Lösungsmittelkabinett bis Purgeventil-Auslauf sollten idealerweise keine Luftblasen sein. Der eingebaute Degasser hat nur eine begrenzte Kapazität, so dass es bei hohen Flussraten nicht zur vollständigen Entgasung kommt.	Initialisierung der quaternären Pumpe und des DAD-Detektors komplett eingeschaltetes System Purgeventil-Auslauf
Nach dem Reinigen wird die Pumpe in "Standby" geschaltet, dabei färbt sich der der"Pumpenpfeil" grau (1, 2, 3, 4). Danach muss das Purgeventil geschlossen (5) werden.	Öffnen des Pumpenmenüs Control OK, Standby Pumpe Standby (grau) Purgeventil schließen

Methode editieren/ erstellen

Um Substanzen auf der HPLC zu trennen braucht man eine Methode. Der einfachste Weg eine neue Methode zu erstellen besteht im editieren einer vorhandenen Methode.

Erklärung	Bild
Zum editieren eine Methode muss der Menüreiter "Methode" ausgewählt werden (1) und " Edit Entire Methode..." angeklickt werden (2).	Methode editieren
Die Editierung aller Bereiche mit Ok (1) bestätigen.	Ok
Im Methoden Informationsbereich sollte eine Übersicht der Methodenparameter eingetragen werden (1) und mit OK (2) bestätigt werden. Name Lösungsmittel-Mischungsverhältnis Flussrate Injektionsvolumen Säulenofentemperatur Detektorwellenlänge Methodendauer In unserem Beispiel: Methode_Doktorand_2 20 % Wasser/Puffer; 80 % Acetonitril; 0,5 mL/min 20 µL RT 254 nm 30 min Diese Informationen bilden die den Header des Reports einer Messung.	Methoden-Info
Im Pump-Einstellungsbereich können pumpenrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (6) bestätigt werden. (1) Lösungsmittel-Mischungsverhältnis (2) Flussrate (3) Methodendauer (4) Druck-Limits (5) Gradienteneinstellungen In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) 20 % Wasser/Puffer; 0 % Acetonitril; 80 %Methanol; 0 % Isopropanol; (2) 2,5 mL/min (3) 30 min (4) 3-200bar (untere Druck nur beim Purgen auf 0 bar setzen, ansonsten besteht die Gefahr, dass die Säule trocken läuft. Das ober Drucklimit ist durch die Druckbeständigkeit des Säulenmaterials und des DAD-Detektors begrenzt. (5) isokratisch	Pumpen-Einstellung
Im Injektions-Einstellungsbereich können injektionsrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (3) bestätigt werden. (1) Injektionsvolumen (2) Injektionsart In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) 20 µL (2) Standard	Injektor-Einstellung
Im DAD-Detektor-Einstellungsbereich können detektorrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. (1) Substanzwellenlängen (Wellenlänge bei dem die Substanz absorbiert), Referenzwellenlänge (liegt in der Regel höher als die zugehörige Signalwellenlänge, hier sollte das Lösungsmittel nicht absorbieren) (2) Detektionszeit (stimmt in der Regel mit Methodendauer überein) (3) verwendete Lampen (Lampen decken unterschiedliche Wellenbereiche ab UV bzw. Vis) (4) UV-Spektrum (hier wird eingestellt zu welchem Zeitpunkt ein gesamtes UV-Absorptionsspektrum online mitgemessen wird) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) Sub: 254 nm; Ref:360nm (2) 30 min (3) UV & Vis (4) All in peak	DAD-Einstellung
Im Messsignal-Einstellungsbereich können die Messsignale der Methode zusortiert werden und mit OK (2) bestätigt werden. (1) Signal (da nur ein Detektor angeschlossen ist, hat man die Wahl zwischen verschiedenen Wellenlängen) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: (1) DAD1 A, Sig=254nm	DAD-Einstellung
Im Report-Einstellungsbereich kann das Format des Reports angepasst werden. Da dies in den meisten Fällen für uns nicht relevant ist und später auch noch während der Auswertung entsprechend angepasst werden kann. Kann hier die Editierung mit Cancel (1) abgebrochen werden.	Report-Einstellung
Anschließend wird der Abbruch mit OK (1) bestätigt.	Report-Einstellung
Zuletzt muß die Methode gespeichert werden (1, 2) und ein gewünschter Methodenname gewählt werden (3, 4). Eine Kommentar zur Änderung ist nicht nötig einfach mit OK (5) bestätigen. Die gespeicherte Methode wird automatisch geladen (6).	Methode speichern Methode speichern Methode speichern Methode speichern

Messen

Nachdem durch "Purgen" die Luft aus den Zuleitungen gespült wurde kann eine zuvor erstellte Methode geladen werden und die Säule mit dem gewünschten Lösungsmittelgemisch ~30 min eingespült werden. Säulen mögen keine zu starken Wechsel in der Polarität des Laufmittels, so dass Wechsel von Laufmittelgemischen mit stark unterschiedlichen Polaritäten sukzessiv erfolgen sollten, um Risse im Säulenbett vorzubeugen.