Agilent 1100/1200 semipräparativ

Aufbau

Eine HPLC setzt sich aus verschiedenen Baugruppen zusammen. Die semipräparative HPLC von Agilnet aus Raum 318 besteht aus folgenden Baugruppen.

Agilent HPLC Semipräp
Baugruppe	Produktnummer/ Seriennummer	Foto	Herstelleranleitung
Lösungsmittel Kabinett		Lösungsmittel Kabinett
Degasser/ Entgasser	G1379A/ JP13208442	Degasser	Degasser
Pumpe	G1311A/ DE82203503	quaternäre Pumpe	quaternäre Pumpe
Autosampler/ Injektor	G1313A/ DE11116863	Autosampler	Autosampler; 900µL Injektorschleife
DAD-Detektor	G1315A/ DE82203687	DAD-Detektor	DAD-Detektor
Fraktionssammler	G1364C/ DE63055760	Fraktionssammler	Fraktionssammler
Steuerelement	G132B/ CN23607228	Steuerelement	Steuerelement
Säulenofen	ST 85P jet/ 50521	Säulenofen	Säulenofen
Lösungsmittelabfall Hinterkolbenspülung		Lösungsmittelabfall-Hinterkolbenspülung
Lösungsmittelabfall (Purgeventil (Pumpe)/ Injektor/ Fraktionssammler)		Lösungsmittelabfall
Rechner (Windows 7)		Rechner

Vorbereitung

Säule

Vor der Inbetriebnahme der HPLC muss die gewünschte Säule eingebaut werden falls diese nicht bereits eingebaut ist. Es ist darauf zu achten, dass die verwendete Säule den gewünschten Bedingungen stand hält (pH, Druck, Lösungsmittel etc.). Bei Einbau ist darauf zu achten, dass die Anschlüsse alle dicht sind. Nach dem Einbau der Säule, kann diese wenn gewünscht im Säulenofen temperiert werden.

Lösungsmittel

* Vor jeder Messung ist es nötig den Füllstand der Lösungsmittelflaschen zu überprüfen. * Es ist darauf zu achten, dass nur Lösungsmittel entsprechender Qualität verwendet werden. In ihnen dürfen sich keine Partikel befinden. Diese würden die Kapillaren und Ventile verstopfen. Korrosive Lösungen (z.B. Alkalilösungen, Salzlösungen und Halogensäuren) dürfen nicht verwendet werden. * Die Lösungsmittel müssen mit der verwendeten Säule kompatibel sein, auch in Bezug auf pH-Wert. * Bei Flussraten größer 2 ml/min empfiehlt es sich die verwendeten Lösungsmittel zuvor zu entgasen. * Bei der Verwendung von Puffer-Lösungen müssen diese zuvor filtriert werden. * Um bakterielles Wachstum zu unterbinden ist der Zusatz von 0,1 % TFA zum Lösungsmittel sinnvoll, ansonsten muss das Wasser bzw. Puffer alle 2 Tage getauscht werden.

Abfall

Alle Abfallbehälter sollten vor Messbeginn geprüft werden und gegebenenfalls geleert oder ausgetauscht werden ( Hinterkolbenspülung nicht vergessen).

Proben

Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Teil der HPLC-Analyse. Um Kontamination der Säule das Ausfallen der Probe auf der Säule zu vermeiden, ist es wichtig die Probe in einem entsprechenden Lösungsmittelverhältnis zu lösen und zu filtrieren. Die Probe sollte zu jeder Zeit gelöst sein und dürfen nicht im Laufmittelgemisch ausfallen. So ist es nicht sinnvoll bei RP-Phase die Probe in reinem Methanol oder ACN zu lösen, da die Gefahr groß ist, dass die Probe bei einem polareren Laufmittelgemisch auf der Säule ausfällt und nicht über die Säule transportiert wird. Das Ausfallen von Proben auf der Säule verursacht zum einen eine Steigerung des Rückdrucks bis hin zur Verstopfung der Säule, zum anderen die Bildung von Kanälen im Säulenmaterial, welches die Trennleistung verschlechtert.

In welchem Lösungsmittelgemisch soll ich nun meine Probe lösen?

Diese Frage kann nicht pauschal beantwortet werden. Es ist wichtig das sie dauerhaft in Lösung ist. Wie kann man dies praktisch machen? Zunächst wiegt man z.B. etwa 1 mg seiner Probe ab und versucht dieses in 500 µL reinem Methanol bzw. ACN zu lösen. Ist dies möglich (klare Lösung) kann in 100 µL Schritten Wasser zugegeben werden, und gleichzeitig beobachtet werden ob etwas ausfällt (Lösung sich eintrübt). Hat man insgesamt 500 µL zu gegeben und die Lösung ist noch klar kann man diese mit einem Spritzenfilter in ein Vial filtrieren. Man hat nun eine Probenlösung mit einem Lösungsmittelverhältnis von 50:50 (Methanol/ACN:Wasser) und kann jetzt ohne Gefahr, dass die Probe ausfällt, alle Laufmittelmischungsverhältnisse zwischen 100% Methanol/ACN und 50:50 Methanol/ACN:Wasser verwendet. Will man für die Trennung ein Laufmittelmischungsverhältnis verwenden, welches einen höheren Wasseranteil hat muss zuvor eine anderes Probenlösungsmittelverhältnis gewählt werden. Fällt während der Zugabe die Probe aus so verringert sich der Laufmittelmischungsverhältnis-Bereich entsprechend.

Fraktionssammler

Falls der Fraktionssammler verwendet werden soll muss dieser zuvor mit Probengläschen bestückt werden.

Starten

Vor dem Starten der HPLC ist es wichtig die entsprechenden Vorbereitungen (siehe vorherigen Absatz) zu treffen.

Erklärung	Bild
Zum Starten der HPLC müssen zunächst die einzelnen Bauelemente angeschaltet werden. # Fraktionssammler # DAD-Detektor # Autosampler/ Injektor # quaternäre Pumpe # Degasser/ Entgasser # Rechner (falls dieser noch nicht läuft)	Startreihenfolge
Um die semipräparative HPLC zu starten muss zunächst die Verknüpfung "Präp LC online" mit einem Doppelklick (linke Maustaste) geöffnet werden.	Desktop
Nach dem Klicken verbinden sich die Bauelemente der HPLC mit dem Rechner.	Start Initializing
Nach dem sich der Fraktionssammler initialisiert hat (1) (~2 min, hierfür muss er geschlossen sein!!), muss eine Methode geladen werden (2).	Methode laden
Hierfür wird der Menüreiter "Load Method" (1) ausgewählt.	Methode laden
Im erscheinenden Menü wird eine der Purge-Methoden, abhängig von bei der Messung verwendeten Kanälen, gewählt. Will man z. B. später mit einer Mischung aus Methanol (Kanal C) und Wasser (Kanal A) die HPLC betreiben würde man Methode "_PURGE_AC_10MiN_2ML_MIN" (1, 2) verwenden. *_PURGE_AB_10MiN_2ML_MIN *_PURGE_ABC_10MiN_2ML_MIN *_PURGE_ABCD_10MiN_2ML_MIN *_PURGE_AC_10MiN_2ML_MIN	Methode laden
Die Ausgewählte Methode wird im Programm angezeigt (1).	Methode laden
Um das HPLC-System zu reinigen muss das Purgeventil geöffnet werden (1) und die HPLC gestartet werden (2).	Purgeventil öffnen Starten der HPLC
Dabei wird die Pumpe und der DAD-Detektor ininitialisiert. Im Schaubild färbt sich sobald das System bereit ist der "Pumpenpfeil" und die "DAD-Detektorwelle" grün. Danach läuft über den Purgeventil-Auslauf Lösungsmittel in den Lösungsmittelabfall. Die Lösungsmittelzuleitungen sollten 5-10 min gespült werden. Im Schlauchsystem von Lösungsmittelkabinett bis Purgeventil-Auslauf sollten idealerweise keine Luftblasen sein. Der eingebaute Degasser hat nur eine begrenzte Kapazität, so dass es bei hohen Flussraten nicht zur vollständigen Entgasung kommt.	Initialisierung der quaternären Pumpe und des DAD-Detektors komplett eingeschaltetes System Purgeventil-Auslauf
Nach dem Reinigen wird die Pumpe in "Standby" geschaltet, dabei färbt sich der der"Pumpenpfeil" grau (1, 2, 3, 4). Danach muss das Purgeventil geschlossen (5) werden.	Öffnen des Pumpenmenüs Control Standby; OK Pumpe Standby (grau) Purgeventil schließen

Methode editieren/ erstellen

Um Substanzen auf der HPLC zu trennen braucht man eine Methode. Der einfachste Weg eine neue Methode zu erstellen besteht im editieren einer vorhandenen Methode.

Erklärung	Bild
Zum editieren eine Methode muss der Menüreiter "Methode" ausgewählt werden (1) und " Edit Entire Methode..." angeklickt werden (2).	Methode editieren
Die Editierung aller Bereiche mit Ok (1) bestätigen.	Ok
Im Methoden Informationsbereich sollte eine Übersicht der Methodenparameter eingetragen werden (1) und mit OK (2) bestätigt werden. *Name *Lösungsmittel-Mischungsverhältnis *Flussrate *Injektionsvolumen *Säulenofentemperatur *Detektorwellenlänge *Info Fraktionssammler *Methodendauer In unserem Beispiel: *Methode_Doktorand_2 *20 % Wasser/Puffer; 0 % Acetonitril; 80 %Methanol; :0 % Isopropanol; *2,5 mL/min *30 µL *RT *254 nm *threshold-peakbased *30 min Diese Informationen bilden die den Header des Reports einer Messung.	Methoden-Info Methoden-Info
Im Pump-Einstellungsbereich können pumpenrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (6) bestätigt werden. :(1) Lösungsmittel-Mischungsverhältnis :(2) Flussrate :(3) Methodendauer :(4) Druck-Limits :(5) Gradienteneinstellungen In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) 20 % Wasser/Puffer; 0 % Acetonitril; 80 %Methanol; ::0 % Isopropanol; :(2) 2,5 mL/min :(3) 30 min :(4) 3-200bar (untere Druck nur beim Purgen auf 0 bar setzen, ansonsten besteht die Gefahr, dass die Säule trocken läuft. Das ober Drucklimit ist durch die Druckbeständigkeit des Säulenmaterials und des DAD-Detektors begrenzt. :(5) isokratisch	Pumpen-Einstellung
Im Injektions-Einstellungsbereich können injektionsrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (3) bestätigt werden. :(1) Injektionsvolumen :(2) Injektionsart In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) 30 µL :(2) Standard	Injektor-Einstellung
Im DAD-Detektor-Einstellungsbereich können detektorrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. :(1) Substanzwellenlängen (Wellenlänge bei dem die Substanz ::absorbiert), Referenzwellenlänge (liegt in der Regel höher als die zugehörige Signalwellenlänge, hier sollte das Lösungsmittel nicht absorbieren) :(2) Detektionszeit (stimmt in der Regel mit Methodendauer ::überein) :(3) verwendete Lampen (Lampen decken unterschiedliche ::Wellenbereiche ab UV bzw. Vis) :(4) UV-Spektrum (hier wird eingestellt zu welchem Zeitpunkt ::ein gesamtes UV-Absorptionsspektrum online mitgemessen wird) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) Sub: 254 nm; Ref:360nm :(2) 30min :(3) UV & Vis :(4) None	DAD-Einstellung
Im Fraktionssammler-Einstellungsbereich können Parameter, die den Fraktionssammler betreffen, eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. :(1) Sammelart (zeitabhängig bzw. peakabhängig) :(2) max. Peakbreite (ist dieser Wert zu gering eingestellt ::wechselt das Auffanggefäß ständig) :(3) Detektorwahl mit Sammelparameter :(4) Wann gesammelt wird? (ob nur eine oder mehrere ::Bedingungen erfüllt sein müssen) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) Peak-based :(2) 6 min :(3) DAD-Detektor; Threshold only, Threshold Unit 10.0 :(4) at least one selected peak detector (da nur ein ::Detektor angeschlossen ist, ist egal was man hier anklickt)	DAD-Einstellung
Im Messsignal-Einstellungsbereich können die Messsignale der Methode zusortiert werden und mit OK (2) bestätigt werden. :(1) Signal (da nur ein Detektor angeschlossen ist, hat man :: die Wahl zwischen verschiedenen Wellenlängen) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) DAD1 A, Sig=254nm	DAD-Einstellung
Im Report-Einstellungsbereich kann das Format des Reports angepasst werden. Da dies in den meisten Fällen für uns nicht relevant ist und später auch noch während der Auswertung entsprechend angepasst werden kann. Kann hier die Editierung mit Cancel (1) abgebrochen werden.	Report-Einstellung
Anschließend wird der Abbruch mit OK (1) bestätigt.	Report-Einstellung
Zuletzt muß die Methode gespeichert werden (1, 2) und ein gewünschter Methodenname gewählt werden (3, 4). Eine Kommentar zur Änderung ist nicht nötig einfach mit OK (5) bestätigen. Die gespeicherte Methode wird automatisch geladen (6).	Methode speichern Methode speichern Methode speichern Methode speichern