Agilent 1100/1200 semipräparativ
!!!IN DAS BENUTZERBUCH EINTRAGEN!!! NICHT VERGESSEN!!!!
In das Benutzerhandbuch sollte der Name des Anwenders, die verwendete Säule und das verwendete Lösungsmittelgemisch und der entsprechende Rückdruck eingetragen werden.
Aufbau
Eine HPLC setzt sich aus verschiedenen Baugruppen zusammen. Die semipräparative HPLC von Agilent aus Raum 309 besteht aus folgenden Baugruppen.
 Agilent HPLC Semipräp | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Baugruppe | Produktnummer/ Seriennummer | Foto | Herstelleranleitung | ||
| Lösungsmittel Kabinett | |||||
| Degasser/ Entgaser | G1379A/ JP13208442 | Degasser | |||
| Pumpe | G1311A/ DE82203503 | quaternäre Pumpe | |||
| Autosampler/ Injektor | G1313A/ DE11116863 | Autosampler; 900µL Injektorschleife | |||
| DAD-Detektor | G1315A/ DE82203687 | DAD-Detektor | |||
| Fraktionssammler | G1364C/ DE63055760 | Fraktionssammler | |||
| Steuerelement | G1323B/ CN23607228 | Steuerelement | |||
| Säulenofen | ST 85P jet/ 50521 | Säulenofen | |||
| Lösungsmittelabfall Hinterkolbenspülung | |||||
| Lösungsmittelabfall (Purgeventil (Pumpe)/ Injektor/ Fraktionssammler) | |||||
| Rechner (Windows 7) | |||||
Vorbereitung
Säule
Vor der Inbetriebnahme der HPLC muss die gewünschte Säule eingebaut werden, falls diese nicht bereits eingebaut ist. Es ist darauf zu achten, dass die verwendete Säule den gewünschten Bedingungen standhält (pH, Druck, Lösungsmittel etc.). Beim Einbau ist darauf zu achten, dass die Anschlüsse alle dicht sind. Nach dem Einbau der Säule kann diese, wenn gewünscht, im Säulenofen temperiert werden.
Lösungsmittel
* Vor jeder Messung ist es nötig den Füllstand der Lösungsmittelflaschen zu überprüfen und nach dem Auffüllen im Programm einzustellen. (Hinterkolbenspülung nicht vergessen) * Es ist darauf zu achten, dass nur Lösungsmittel entsprechender Qualität verwendet werden. In ihnen dürfen sich keine Partikel befinden. Diese würden die Kapillaren und Ventile verstopfen. Korrosive Lösungen (z.B. Alkalilösungen, Salzlösungen und Halogensäuren) dürfen nicht verwendet werden. * Die Lösungsmittel müssen mit der verwendeten Säule kompatibel sein, auch in Bezug auf pH-Wert. * Bei Flussraten größer 2 ml/min empfiehlt es sich die verwendeten Lösungsmittel zuvor zu entgasen. * Bei der Verwendung von Puffer-Lösungen müssen diese zuvor filtriert werden. * Um bakterielles Wachstum zu unterbinden ist der Zusatz von 0,1 % TFA zum Lösungsmittel sinnvoll, ansonsten muss das Wasser bzw. Puffer alle 2 Tage getauscht werden.
Abfall
Alle Abfallbehälter sollten vor Messbeginn geprüft werden und gegebenenfalls geleert oder ausgetauscht werden ( Hinterkolbenspülung nicht vergessen).
Proben
Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Teil der HPLC-Analyse. Um Kontamination der Säule das Ausfallen der Probe auf der Säule zu vermeiden, ist es wichtig die Probe in einem entsprechenden Lösungsmittelverhältnis zu lösen und zu filtrieren. Die Probe sollte zu jeder Zeit gelöst sein und darf nicht im Laufmittelgemisch ausfallen. So ist es nicht sinnvoll bei RP-Phase die Probe in reinem Methanol oder ACN zu lösen, da die Gefahr groß ist, dass die Probe bei einem polareren Laufmittelgemisch auf der Säule ausfällt und nicht über die Säule transportiert wird. Das Ausfallen von Proben auf der Säule verursacht zum einen eine Steigerung des Rückdrucks bis hin zur Verstopfung der Säule, zum anderen die Bildung von Kanälen im Säulenmaterial, welches die Trennleistung verschlechtert. Idealerweise wird die Probe direkt in ein Glasvial filtriert und mit einem Deckel mit Septum mit der Bördelzange von Hand verschlossen.
In welchem Lösungsmittelgemisch soll ich nun meine Probe lösen?
Da für die semipräparative Reinigung in der Regel zuvor an der analytischen HPLC eine Methode entwickelt wurde, kann auf Grundlage der dabei gesammelten Erfahrung ein sinnvolles Probenlösungsmittelgemisch ausgewählt werden.
Fraktionssammler
Falls der Fraktionssammler verwendet werden soll muss dieser zuvor mit kleinen Probengläschen bestückt werden.
Starten
Vor dem Starten der HPLC ist es wichtig die entsprechenden Vorbereitungen (siehe vorherigen Absatz) zu treffen.
| Erklärung | Bild |
|---|---|
| Zum Starten der HPLC müssen zunächst die einzelnen Bauelemente angeschaltet werden. # Fraktionssammler # DAD-Detektor # Autosampler/ Injektor # quaternäre Pumpe # Degasser/ Entgaser # Rechner (falls dieser noch nicht läuft) | |
| Um die semipräparative HPLC zu starten muss zunächst die Verknüpfung "Präp LC online" mit einem Doppelklick (linke Maustaste) geöffnet werden. | |
| Nach dem Klicken verbinden sich die Bauelemente der HPLC mit dem Rechner. | |
| Nach dem sich der Fraktionssammler initialisiert hat (1) (~2 min, hierfür muss er geschlossen sein!!), muss eine Methode geladen werden (2). | |
| Hierfür wird der Menüreiter "Load Method" (1) ausgewählt. | |
| Im erscheinenden Menü wird eine der Purge-Methoden, abhängig von bei der Messung verwendeten Kanälen, gewählt. Will man z. B. später mit einer Mischung aus Methanol (Kanal C) und Wasser (Kanal A) die HPLC betreiben würde man Methode "_PURGE_AC_10MiN_2ML_MIN" (1, 2) verwenden. *_PURGE_AB_10MiN_2ML_MIN *_PURGE_ABC_10MiN_2ML_MIN *_PURGE_ABCD_10MiN_2ML_MIN *_PURGE_AC_10MiN_2ML_MIN | |
| Die Ausgewählte Methode wird im Programm angezeigt (1). | |
| Um das HPLC-System zu reinigen muss das Purgeventil geöffnet werden (1) und die HPLC gestartet werden (2). | |
| Dabei wird die Pumpe und der DAD-Detektor initialisiert. Im Schaubild färbt sich sobald das System bereit ist der "Pumpenpfeil" und die "DAD-Detektorwelle" grün. Danach läuft über den Purgeventil-Auslauf Lösungsmittel in den Lösungsmittelabfall. Die Lösungsmittelzuleitungen sollten 5-10 min gespült werden. Im Schlauchsystem von Lösungsmittelkabinett bis Purgeventil-Auslauf sollten idealerweise keine Luftblasen sein. Der eingebaute Degaser hat nur eine begrenzte Kapazität, so dass es bei hohen Flussraten nicht zur vollständigen Entgasung kommt. | |
| Nach dem Reinigen wird die Pumpe in "Standby" geschaltet, dabei färbt sich der der "Pumpenpfeil" grau (1, 2, 3, 4). Danach muss das Purgeventil geschlossen (5) werden. |
Methode editieren/ erstellen
Um Substanzen auf der HPLC zu trennen braucht man eine Methode. Der einfachste Weg eine neue Methode zu erstellen besteht im Editieren einer vorhandenen Methode.
| Erklärung | Bild |
|---|---|
| Zum editieren eine Methode muss der Menüreiter "Methode" ausgewählt werden (1) und " Edit Entire Methode..." angeklickt werden (2). | |
| Die Editierung aller Bereiche mit Ok (1) bestätigen. | |
| Im Methoden Informationsbereich sollte eine Übersicht der Methodenparameter eingetragen werden (1) und mit OK (2) bestätigt werden. *Name *Lösungsmittel-Mischungsverhältnis *Flussrate *Injektionsvolumen *Säulenofentemperatur *Detektorwellenlänge *Info Fraktionssammler *Methodendauer In unserem Beispiel: *Methode_Doktorand_2 *20 % Wasser/Puffer; 0 % Acetonitril; 80 %Methanol; :0 % Isopropanol; *2,5 mL/min *30 µL *RT *254 nm *threshold-peakbased *30 min Diese Informationen bilden die den Header des Reports einer Messung. | |
| Im Pump-Einstellungsbereich können pumpenrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (6) bestätigt werden. :(1) Lösungsmittel-Mischungsverhältnis :(2) Flussrate :(3) Methodendauer :(4) Druck-Limits :(5) Gradienteneinstellungen In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) 20 % Wasser/Puffer; 0 % Acetonitril; 80 %Methanol; ::0 % Isopropanol; :(2) 2,5 mL/min :(3) 30 min :(4) 3-200bar (untere Druck nur beim Purgen auf 0 bar setzen, ansonsten besteht die Gefahr, dass die Säule trocken läuft. Das ober Drucklimit ist durch die Druckbeständigkeit des Säulenmaterials und des DAD-Detektors begrenzt. :(5) isokratisch | |
| Im Injektions-Einstellungsbereich können injektionsrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (3) bestätigt werden. :(1) Injektionsvolumen :(2) Injektionsart In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) 30 µL :(2) Standard | |
| Im DAD-Detektor-Einstellungsbereich können detektorrelevante Parameter eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. :(1) Substanzwellenlängen (Wellenlänge bei dem die Substanz ::absorbiert), Referenzwellenlänge (liegt in der Regel höher als die zugehörige Signalwellenlänge, hier sollte das Lösungsmittel nicht absorbieren) :(2) Detektionszeit (stimmt in der Regel mit Methodendauer ::überein) :(3) verwendete Lampen (Lampen decken unterschiedliche ::Wellenbereiche ab UV bzw. Vis) :(4) UV-Spektrum (hier wird eingestellt zu welchem Zeitpunkt ::ein gesamtes UV-Absorptionsspektrum online mitgemessen wird) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) Sub: 254 nm; Ref:360nm :(2) 30min :(3) UV & Vis :(4) None | |
| Im Fraktionssammler-Einstellungsbereich können Parameter, die den Fraktionssammler betreffen, eingetragen werden und mit OK (5) bestätigt werden. :(1) Sammelart (zeitabhängig bzw. peakabhängig) :(2) max. Peakbreite (ist dieser Wert zu gering eingestellt ::wechselt das Auffanggefäß ständig) :(3) Detektorwahl mit Sammelparameter :(4) Wann gesammelt wird? (ob nur eine oder mehrere ::Bedingungen erfüllt sein müssen) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) Peak-based :(2) 6 min :(3) DAD-Detektor; Threshold only, Threshold Unit 10.0 :(4) at least one selected peak detector (da nur ein ::Detektor angeschlossen ist, ist egal was man hier anklickt) | |
| Im Messsignal-Einstellungsbereich können die Messsignale der Methode zu sortiert werden und mit OK (2) bestätigt werden. :(1) Signal (da nur ein Detektor angeschlossen ist, hat man :: die Wahl zwischen verschiedenen Wellenlängen) In unserem Beispiel Methode_Doktorand_2: :(1) DAD1 A, Sig=254nm | |
| Im Report-Einstellungsbereich kann das Format des Reports angepasst werden. Da dies in den meisten Fällen für uns nicht relevant ist und später auch noch während der Auswertung entsprechend angepasst werden kann. Kann hier die Editierung mit Cancel (1) abgebrochen werden. | |
| Anschließend wird der Abbruch mit OK (1) bestätigt. | |
| Zuletzt muss die Methode gespeichert werden (1, 2) und ein gewünschter Methodenname gewählt werden (3, 4). Ein Kommentar zur Änderung ist nicht nötig einfach mit OK (5) bestätigen. Die gespeicherte Methode wird automatisch geladen (6). |
Messen
Nachdem durch "Purgen" die Luft aus den Zuleitungen gespült wurde kann eine zuvor erstellte Methode geladen werden und die Säule mit dem gewünschten Lösungsmittelgemisch ~30 min eingespült werden. Säulen mögen keine zu starken Wechsel in der Polarität des Laufmittels, so dass Wechsel von Laufmittelgemischen mit stark unterschiedlichen Polaritäten sukzessiv erfolgen sollten, um Risse im Säulenbett vorzubeugen. Nach dem Einspülen der Säule müssen die vorbereiteten Proben in den Probentisch des Autosamplers gestellt werden und Angaben zu Position etc. in die Sequenztabelle eingetragen werden.
Probentabelle erstellen
| Erklärung | Bild |
|---|---|
| Zum Erstellen der Sequenztabelle muss zunächst das Probentischsymbol angeklickt werden (1) und der Menüreiter "Sequence table" ausgewählt werden. (2). | |
| In der sich öffnenden Sequenztabelle kann die Position des Vials (1), der Name der Probe (2) die gewünschte Methode (3) und die Anzahl der Injektionen/Messungen (4) der Probe eingegeben werden. Will man mehr als eine Probe messen kann man durch klicken von "Insert" (5) eine neue Zeile oberhalb, durch klicken von "Append Line" (6) eine Zeile unterhalb einfügen und wie zuvor ausfüllen. Mit " Undo All" (7) stellt man den Ursprung der Tabelle wieder her. Nach der Eingabe aller zu vermessenden Proben wird die Eingabe mit (8) bestätigt. | |
| Nachdem man zurück ins "Hauptmenü" gekommen ist muss erneut das Probentischsymbol angeklickt werden (1), aber diesmal der Menüreiter "Sequence Parameters..." ausgewählt werden. (2). | |
| In dem sich öffnenden Menüfenster kann der Speicherort der gemessenen Chromatogramme bestimmt werden (1). Außerdem wird hier auch der Dateiname inklusive Nummerierung festgelegt wenn eine ganze Sequenz gemessen wird (3). In diesem Menüfenster wird auch der Anwender eingetragen der später auf dem Report erscheint (2). Hat man alle Änderungen eingetragen bestättigt man diese mit "OK" (4). |
Messung starten
| Erklärung | Bild |
|---|---|
| Zurück im Hauptmenü kann durch Anklicken von Start (1) die Messung gestartet werden. Bei laufender Messung Sind die Symbole für Injektor, Säule und DAD-Detektor blau. | |
| Ist Messung fertig speichert sich automatisch das Chromatogramm beim unter "Sequence Parameter" angegebenen Ort ab und es öffnet sich ein Report den man ausdrucken kann. Die Messdaten können später auch noch offline eingesehen und ausgewertet werden. |
Spülen
Hat man die letzte Messung beendet muss die Säule gespült werden und im vom Hersteller angegebenen Lösungsmittelgemisch gelagert werden. Üblicherweise werden die Säulen 20-30 min mit einem Lösungsmittelgemisch gespült, welches einen höheren organischen Anteil hat als jenes, welches zuvor für die Messung verwendet wurde. Hierfür lädt man am besten eine entsprechende Spülmethode. Nach dem Spülen wechselt man dann zum vom Hersteller angegebenen Lösungsmittelgemisch und konditioniert sie für weitere 10 min, bevor man die Pumpe im Programm ausschaltet.
| Erklärung | Bild |
|---|---|
| Eine Möglichkeit für die Spül- und Konditionierung-Prozedur besteht im Schreiben und Starten einer entsprechender Sequenz. Dazu ruft man den "Sequence table" auf (1) und trägt hier eine Spül- (2) und Konditionierungs-Sequenz (3) ein. Anschließend bestätigt man diese mit OK (4). | |
| Im Folgenden ruft man das "Sequence Parameter" Menü auf (5). Dort kann man einstellen das sobald er mit der Messung der Sequenz fertig die UV-Lampe und die Pumpe ausgeschaltet wird (6). Diese Einstellung bestätigt man mit OK (7) und startet diese (8). |
Schließen
| Erklärung | Bild |
|---|---|
| Ist die Sequenz durchgelaufen, öffnet sich das Reportfenster und die Pumpe und die UV-Lampe schalten sich aus. Nun kann das Reportfenster geschlossen werden (1) | |
| Da die Pumpe und die UV-Lampe ausgeschalte sind (grau) (2,3), kann nun das Programm geschlossen werden (4). | |
| Die Nachfrage ob man das Programm wirklich schließen will kann einfach bestätigt werden (1), ebenso die Frage ob die Pumpe und die Lampe aus ist (2), falls diese grau unterlegt sind. |
Auswerten
Die Auswertung kann entweder an Hand des ausgedruckten Reports oder an Hand eines im offline Programm von Chemstation modifizierten Reports erfolgen. Von Interesse sind hierbei insbesondere die Retentionszeiten und Integrale der einzelnen Signale, auch das UV-Spektrum der einzelnen Signale gibt wichtige Hinweise.
Abschließende Hinweise
Vor Verwendung der HPLC ist es sinnvoll seine Zielsetzung klar zu definieren. Es bietet sich auch an für eine gute Dokumentation bei jeder Messungen ein Laufzettel zu verwenden, in dem alle Parameter der Messung vermerkt sind um eine Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Ein Vordruck kann hier oder im Desktopbereich des HPLC-Computers gefunden werden und bei Bedarf ausgedruckt werden.